En 1565 se edificó la segunda Catedral de Guadalajara: un jacal grande de tres naves, con cimientos de piedra, muros de adobe, columnas, piso y techo de madera, cubierto con paja.

Dicen las crónicas que en la fiesta del Espíritu Santo del año de 1574, a la hora de cantar la Gloria, un entusiasta aunque imprudente feligrés, disparó un arcabús al aire como demostración de júbilo, y la bala cayó en el techo de paja incendiándolo.

Hubo necesidad de edificar una tercera Catedral y el segundo Obispo de la Nueva Galicia, fray Pedro de Ayala, bendijo la primera piedra el 31 de julio de 1568, en el sitio que hasta hoy ocupa.

A principios del siglo XVIII era una espléndida catedral barroca con diecisiete altares, pero a fines de esa centuria surgió en España la moda neoclásica y la moda llegó a la iglesia. El obispo Juan Ruiz de Cabañas y Crespo ordenó a principios del siglo XIX que los altares barrocos fueran substituidos por neoclásicos perdiéndose así invaluables obras de arte.

El altar mayor, que sustituyó al de plata que fue fundido durante la Guerra de Tres Años, fue encargado a Génova por el obispo Pedro Espinoza; es de mármol de Carrara, de estilo neoclásico, se estrenó en 1863; fue conocido como el ciprés y estuvo en ese sitio sitio hasta marzo de 1993 en que fue removido.

El coro ocupa el testero de la nave principal; antiguamente estuvo ahí el altar de los Reyes. Sobre él se alza la cúpula de 1875 obra de Domingo Torres. En las pechinas los cuatro Evangelistas, frescos de Carlos Villaseñor, de la segunda mitad del siglo XIX.

La sillería (del coro) está tallada en madera de cocolobo, traída de Amatlán de Cañas, Nayarit. Obra de Luis Monsivais, terminada en 1847.